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收藏  |   舉報 2011-02-19 12:33   關注:6414   回答:1

Enterokinase是什么酶?

已解決 懸賞分:5 - 解決時間 2011-02-20 15:44
  支持(3)  |   反對(5)  |   舉報 2011-02-20 15:31
腸激酶(Enterokinase, EK)最早由Schepovalnikow于1899年在Pavlov的實驗室發現,Kunitz于1939年證實了腸激酶是胰蛋白酶原的生理激活劑。由于胰蛋白酶是消化系統其它許多酶原的激活劑,因而腸激酶被認為是消化系統重要的起始酶之一。 腸激酶是哺乳動物特有的一種絲氨酸蛋白酶,迄今為止已從人、牛、鼠、豬等純化了天然的腸激酶,其中以牛的腸激酶理化性質研究的最為透徹。天然的牛腸激酶由一條115KD的重鏈(結構亞基)和一條35KD的輕鏈(催化亞基)以一個二硫鍵連接而成。其中,結構亞基把催化亞基附著在腸粘膜刷狀緣上并朝向腸腔,催化亞基能特異性識別胰蛋白酶原中五肽序列(Asp)4-Lys并在其羧基端切斷肽鏈,釋放出活性胰蛋白酶。Light和Fonseca進一步證實了單獨的牛腸激酶輕鏈仍具有全酶所具有的特異性切割活性。牛腸激酶在PH5~PH9之間、溫度4℃~37℃之間均能保持其特異的切割活性,且位點特異性強、切割活性高,因而非常適合基因工程產品中融合蛋白的切割。 基因工程技術發展到今天,已經在許多環節上作了創新,其中很重要的一個方面就是在目的蛋白質產物N端連接上各種功能性肽段構建成融合蛋白,以達到提高表達水平、改變表達類型(由細胞內表達轉變為分泌型表達)、改善產物的溶解性、簡化產物提純步驟等等目的。這些構思精巧的表達策略極大地推動了基因工程在生命科學領域的應用,但是,各種人為添加的肽段也產生了一些新問題,因為在很多研究中,真正需要的是沒有附加片段的目的蛋白質,而額外添加的肽段(即使是很短的)往往會影響產物蛋白質的功能,干擾實驗結果;更重要的是,各類用于人體治療的基因工程藥物(特別是注射用藥)必須嚴格符合氨基酸序列的設計要求,額外增加的肽段會引起很多嚴重問題,例如引發人體產生抗藥物抗體等等。因此,能否有效而完整地把上述各種融合肽段切除并再生出目的蛋白質就成為各種創新表達策略最終取得成功的關鍵。 于是,高度特異性的牛腸激酶就成為解決上述問題的首選工具,牛腸激酶的活性中心有一個獨特的陽離子位點,可以和帶強負電的(Asp)4相互作用而促使酶與底物的結合。幾乎所有物種的胰蛋白酶原都含有這樣的(Asp)4四肽序列,而(Asp)4-Lys序列在其他的天然蛋白質上又非常罕見,因此,牛腸激酶的底物酶切位點序列具有高度的特異性,這種特點使其成為基因工程融合蛋白表達后修飾過程中一個極其有用的工具。研究者們在融合蛋白的功能性肽段與目的產物之間設計了一個牛腸激酶的作用位點序列,表達后的融合蛋白再經過牛腸激酶作用,就除去了功能性肽段,而其罕見的作用位點序列避免了目的蛋白質產物被酶切降解的可能性,最終再生獲得了符合要求的目的產物。雖然世界各地的研究機構和生產廠家也有使用其他蛋白酶作為再生工具的,但百分之九十以上的使用者選用牛腸激酶。 目前,全世界每年發表的與牛腸激酶這個用途有關的文獻很多,可謂不勝枚舉。在此,我們只舉幾個近年來比較典型的例子來具體說明一下其實際應用。 A)1999年,美國農業生物技術中心(馬里蘭州)構建了新型的桿狀病毒表達載體,這種載體在依次添加了一段6組氨酸親和配體序列、綠熒光蛋白(GFP)序列以及牛腸激酶作用位點序列。用此表達載體生產人白介素-2(hIL-2)以及氯霉素乙酰轉移酶(CAT),在幼蟲體內都獲得了高效表達。令人矚目的是,此項載體N端修飾技術是一次對昆蟲表達系統的革新并使其將很快普及成為被廣泛應用的新一代表達宿主。因為使用了GFP作為熒光標記,能清楚地確定轉染過程、收獲時間以及蛋白質產量,還省去了表達、分離和純化過程中做免疫印染(Western Blot)的繁瑣步驟,并且提純產品時可以快速鑒定洗脫液和流穿液中產物蛋白質的含量。根據熒光強度與目的蛋白質(hIL-2以及CAT)含量成線性正比的關系,篩選到最高表達水平的幼蟲(比平均水平高3倍)。因GFP和目的產物共存于融合蛋白上故能直接篩選表達宿主,使得轉染和表達生產成為一個連續過程,改變了目前批過程的狀況。最后,利用N端另一個功能肽段--6組氨酸親和配體,以金屬離子親和層析法提純此融合蛋白后,用牛腸激酶切除N端附加的功能汰,就再生了目的產物。 這家研究中心已計劃對這項技術進行商品化開發。 B)1999年,韓國生物科學與技術研究所構建了一個新型的大腸桿菌表達載體,在目的蛋白質的N端依次添加了以下的肽段:來源于釀酒酵母的羧肽酶Y(CPY)前肽、6組氨酸親和配體、牛腸激酶作用位點序列。CPY前肽能提高短肽產物在大腸桿菌中的表達效率,而6組氨酸親和配體與金屬離子親和層析柱的高效結合極大地簡化融合蛋白的純化步驟。用此載體成功地高效表達了一些有臨床價值的蛋白質激素,如人甲狀旁腺激素片斷、人胰高血糖素等等。融合蛋白經牛腸激酶作用后用反向HPLC分析,顯示再生的目的產物與天然蛋白完全相同。 C)1998年,同是這家韓國研究所構建了高效表達人生長激素的新型大腸桿菌表達載體,在生長激素的N端依次添加了以下肽段:人a腫瘤壞死因子(hTNF-a)N端的五肽序列,6組氨酸親和配體、牛腸激酶作用位點序列。其中hTNF-aN端的五肽片段極大地提高了生長激素的表達水平。這個高效表達載體的構建成功,使得這個研究所的人生長激素項目進入了規模生產的階段。 D)1995年,挪威Bergen大學構建了表達人苯丙氨酸羥化酶(hPAH)的新型大腸桿菌表達載體,在目的蛋白hPAH的N端依次加上了大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MBP)以及牛腸激酶作用位點序列。hPAH在普通載體pET內表達后非常容易被宿主細胞的蛋白酶降解,純化產量很低。而用新型載體以融合蛋白的形式表達后,hPAH就能抵抗宿主細胞蛋白酶的降解作用,并且可以用直鏈淀粉樹脂親和層析法極為簡便地提純。經牛腸激酶作用并經過離子交換(DEAE)層析,獲得了高產量、高純度的再生hPAH,其催化活性和理化性質與來源于人體肝臟的天然hPAH完全相同。 最為重要的是:美國FDA于1997年批準的基因工程新藥—重組人白介素11,就是采用融合蛋白表達,再利用腸激酶切割獲得重組人白介素11單體。國內已有多家研究機構開發的重組人白介素11也是采用這一技術路線。 從動物體內純化天然腸激酶成本高,同時易混入其它蛋白酶,是其大規模應用的限制因素。采用基因工程方法可有望解決這一問題。
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